Introdução à Investigação Laboratorial
Código
101026
Unidade Orgânica
Faculdade de Ciências Médicas
Departamento
Gabinete de Estudos Pós-Graduados
Créditos
15
Professor responsável
Prof Doutor Helder Trindade
Língua de ensino
Português
Objectivos
Pretende-se que os alunos tomem conhecimento de metodologias diversas e técnicas laboratoriais que sejam abrangentes e cuja diversidade permita desenhar estratégias de investigação para questões científicas concretas, com aplicação das técnicas laboratoriais com interesse translacional.
Pretende-se que fiquem aptos para utilizar células animais em cultura, que adquiram a formação teórica mínima (aceite por lei) em ciências de animais de laboratório e um curso prático de experimentação animal, que permitirá completar a formação mínima exigida por lei para obter creditação para investigação no modelo animal e que trabalhem «hands-on» com técnicas expeditas e modernas de Biologia Celular e Molecular, Imunoensaios, Citometria de Fluxo, Microscopia Confocal, Análise Genética, Anatomia Patológica.
Pré-requisitos
Não tem
Conteúdo
Módulo I:Segurança e Boas Práticas Laboratoriais
Regras básicas de segurança em laboratório. Equipamento de segurança: protecção individual e protecção colectiva. Símbolos e frases de risco. Armazenamento e manipulação de produtos químicos. Risco biológico e biossegurança: classificação de microrganismos em grupos de risco, prevenção e minimização de riscos na manipulação de microrganismos. Níveis de segurança biológica: requisitos para laboratórios com diferentes níveis de segurança biológica; requisitos para laboratórios com manipulação de animais. Requisitos particulares de segurança: Microbiologia, Culturas celulares, Biologia molecular, RIA. Gestão e eliminação de resíduos: resíduos químicos; resíduos biológicos; processos de descontaminação. Risco ocupacional e acidentes de trabalho. Boas práticas e qualidade no laboratório. Legislação aplicável a laboratórios de investigação. Normas de Certificação e Acreditação de laboratórios de ensaio. Validação de métodos. Noções de Controlo Interno de Qualidade e Avaliação Externa da Qualidade / Ensaios interlaboratoriais. Normas de utilização e segurança de material de laboratório: câmaras de fluxo laminar, pipetas, centrífugas, agitadores e sonicadores, estufas e equipamentos de frio, autoclaves. Acidentes de trabalho: modos de acção. Como evitar contaminações / processos de descontaminação (em culturas celulares, Biologia molecular, equipamentos e instalações). Gestão e eliminação de resíduos.Manual de segurança do laboratório. Validação de métodos e ensaios. Aplicação de regras de Controlo de Qualidade.
Módulo II: Técnicas de Análise Genética
O laboratório de Biologia Molecular (Equipamento, logística). Introdução de conceitos básicos de Biologia Molecular. Métodos de purificação e isolamento de ácidos nucleicos; análise de polimorfismos e genotipagem. Isolamento de DNA de amostras biológicas, quantificação espectrofotometrica e análise do grau de pureza. Analise de polimorfismo nucleotido singular por sondas Taqman. Métodos de quantificação da expressão genética. Microarrays e PCR em tempo real: princípios, bases de dados de ensaios e aplicações.Isolamento e purificação de RNA de amostras biológicas, quantificação e transcripção reversa em DNA complementar. Delineamento e execução de ensaios para quantificação da expressão genética por PCR em tempo real. Análise de polimorfismos e genotipagem de DNA humano. Seminários Snapshots conduzidos por especialistas da área sobre as mais avançadas técnicas e sobre aplicações práticas de diversas técnicas de Biologia Molecular, na resolução de problemas científicos em diversas áreas de investigação: Microarrays, Métodos de silenciamento de genes, entre outros temas
Módulo III: Introdução à Cultura de Células Animais
Vantagens e limitações do uso de culturas celulares, utilização de linhagens celulares contínuas versus culturas primária, técnica asséptica e esterilização de material, composição dos meios de cultura, suplementos e soluções salinas, técnicas de rotina como sementeira, subcultura e criopreservação, contaminações e diferentes técnicas de cultura em diferentes substratos. Sementeira a partir de amostra congelada, subcultura de uma linhagem celular, testes de viabilidade, contagens celulares e cálculo de diluições, criopreservação, observação de diferentes linhagens celulares.
Módulo IV: Introdução à Microscopia Confocal
Fluorescência e Fluorocromos; Microscopia de Fluorescência vs Microscopia Confocal: Exemplos de Aplicações: Marcação de epítopos, de organelos/estruturas intracelulares, co-localização de moléculas, FISH, FRET, FRAP, localização de proteínas fluorescentes (GFP),Análise de ROS, FLIM, FLIP, FLAP; Técnicas de preparação de lâminas; Preparação de amostras biológicas para posterior análise de estruturas e processos celulares (ex: endocitose, alterações fenotípicas por estimulação celular, co-localização); Técnicas avançadas e aplicações de sistemas 3D Live Cell Imaging; O microscópio confocal de varrimento laser: componentes (lasers, pinhole, fotomultiplicadores, etc) e modo de funcionamento; Visualização de amostras previamente preparadas pelos alunos e outras (aquisição de várias fluorocrómos em simultâneo, resolução de problemas de cross-talk de fluorescências, aquisição de imagens 3D-séries Z); Processamento de Imagens e interpretação de resultados
Módulo V Experimentação Animal
Anatomia e fisiologia de roedores e lagomorfos, alimentação e nutrição de roedores e lagomorfos, acomodação de roedores e lagomorfos: macro-ambiente, acomodação de roedores e lagomorfos: microambiente, comportamento e ambiente, bem-estar animal e sinais de perturbação, padronização e manipulação genética, manipulação, contenção e métodos de identificação, gestão de colónias, estatuto sanitário e microbiológico, biocontenção e bioexclusão como prevenção/controlo de infecções, transporte de animais, anestesia e analgesia, cuidados pré e pós cirúrgicos e princípios básicos de cirurgia, administração de substâncias e colheita de amostras, eutanásia, ética e os 3 Rs, integridade científica e desenho experimental, saúde e segurança no contacto com animais, legislação e recomendações europeias e nacionais.Rotinas de manutenção de animais como: mudança de caixas em câmara de bio-segurança, identificação de estro e visualização de plug copulatório em murganho, utilização de caixas metabólicas, transporte e acondicionamento bem como identificação e escolha entre diferentes tipos de cama, ninho e materiais de enriquecimento ambiental. Haverá uma visita a um Biotério fazendo a integração dos conteúdos do módulo teórico. Nas sessões práticas inclui-se o treino de manuseamento e contenção além da utilização de diferentes métodos de marcação permanente e temporária de acordo. O respeito pelos princípios de bem-estar animal e facilidade para o operador acompanham todas as sessões. Serão treinadas várias vias de colheita de amostras biológicas e várias vias de administração de substâncias. Pretende-se que os participantes fiquem com bases para saber escolher e executar correctamente os procedimentos.
Módulo VI: Citometria de Fluxo e Imunoensaios
Princípios e fundamentos da Citometria de Fluxo. Tipos de amostra e seu processamento. Estratégias de análise e suas aplicações. Apresentação de resultados e sua interpretação. Aplicações da Citometria de Fluxo:Imunofenotipagem celular e citometria policromática. Proliferação celular. Estudos de apoptose. Avaliação do ciclo celular. Ensaios funcionais. Cell sorting. Immunoensaios para quantificação de biomoléculas. Ensaios Multiplex: tecnologia Luminex e tecnologia CBA (Cytometric Bead Array).Aplicação de Imunoensaios no diagnóstico e prognóstico das Doenças Autoimunes, Doenças Infecciosas, Doenças Alérgicas e Imunodeficiências. Identificação dos elementos constituintes do citómetro de fluxo, calibrações e compensações. Como construir um painel em função do teste pretendido. Como construir um template de aquisição e de análise. Que software utilizar. Anticorpos monoclonais utilizados para definir linhagem hematopoiética. Utilização de outros reagentes em citometria de fluxo. Número de eventos a adquirir de acordo com a questão formulada. Estudo das subpopulações linfocitárias em sangue periférico (células T, B e NK). Identificação das restantes populações leucocitárias. Exemplos de avaliação do estádio maturativo das células hematopoiéticas. Ensaios funcionais: desgranulação de basófilos, fagocitose e metabolismo oxidativo das células fagocitárias. Isolamento de populações celulares (Cell sorting). Apoptose e ciclo celular.Demonstração de imunoensaios. Ensaios Multiplex. de avaliação da activação celular.
Módulo VII Biotecnologia Molecular: Como aplicar à patologia
Doenças humanas: patologia molecular. Hereditariedade mendeliana e outros padrões de hereditariedade.; Doenças mendelianas complexas: doença Charcot-Marie-Tooth e miocardiopatia hipertrófica;Doenças multifactoriais. Técnicas de diagnóstico genético; Genótipo e perfil genético; Tipos de mutações (pontuais,inserções, delecções e repetições); Estratégias de identificação de mutações; Mutações desconhecidas (single strand conformation polymorphism, denaturating gradient gel electrophoresis, denaturating high performance liquid chromatography, sequenciação de ADN,HRM). Mutações conhecidas (Allele Specific Oligonucleotide, Amplification-Refractory Mutation System, Oligonucleotide ligation assay e Primer-introduced restriction analysis; hibridação reversa; TaqMan, IPLEX- MALDI-TOF). Grandes delecções/amplificações (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, Array-CGH); Análise e clonagem de genes humanos na era pós-genómica; A sequenciação do genoma humano; Genes humanos;Análise funcional de genes humanos; Aplicações em diagnóstico clínico. Produção de proteínas recombinants; Produção de proteínas heterólogas em células eucarioticas; Sistemas de expressão em Saccharomyces cerevisiae; Expressão em células de insecto-Baculovuris; Expressão em células de mamífero em cultura- Mutagénese dirigida
Localização subcelular de proteínas por microscopia de fluorescência; Microscopia de fluorescência; Efeito de mutações na localização subcelular de proteínas. Extracção de ADN a partir de diferentes amostras biológicas; Desenho de primers para amplificação por PCR dos genes de interesse; Genotipagem simples e em larga escala. Desenho de primers para clonagem dos genes de interesse; Amplificação de cDNA; Enzimas de restrição. Digestão dos cADNs; Extracção de ADN plasmídico; Digestão com enzimas de restrição.Ligação. Transformação e Selecção de transformantes; Mutagénese dirigida.Visualização ao microscópio de fluorescência das proteínas recombinantes selvagem e mutante por recurso a fusões cADN-GFP; Identificação de alterações na sua localização subcelular.
Módulo VIII Anatomia Patológica I
Estudo dos mecanismos e manifestações morfológicas comuns e importantes das doenças humanas. Adaptação celular e Senescência, Lesão e Morte Celular, Inflamação e Neoplasia. Observação de preparações histo-patológicas em microscópico óptico de multi-observadores. Prática de selecção de amostras e de processamento de amostras para estudo histo-patológico; execução e de interpretação das técnicas de imuno-histoquímica e de hibridação in situ. Introdução à microscopia electrónica.
Módulo IX Técnicas de Análise de Proteínas
Conceitos de proteínas proteómica. Técnicas fundamentais de análise de proteínas- quantificação, isolamento, purificação, cromatografia, electroforese. Técnicas de imunobloting -Western blot e ELISA e variantes. Imunoprecipitação. Quantificação de proteínas por espectrofotometria. Electroforese em gel SDS-PAGE, Western blot. Quantificação relativa de proteínas específicas pela metodologia TaqMan® Protein Expression Assays Deborah. Introdução à proteómica. Técnicas de separação de proteínas em larga - gel-based proteomics vs gel-free proteomics. Espectrometria de massa aplicada à proteómica - conceitos básicos de espectrometria de massa na identificação de proteínas.Separação de proteínas por 2D-PAGE e identificação de spots de proteínas por MALDI-TOF/TOF.
Módulo X Anatomia Patológica II
Revisão dos conceitos básicos de regulação epigenética, nomeadamente a importância da metilação do DNA e da metilação e acetilação de histonas na regulação da expressão génica. Descrição das alterações epigenéticas que ocorrem em neoplasias. Compreensão da importância dos inibidores de desacetilases de histonas, como agentes de regulação epigenética, no tratamento de neoplasias. Utilização de inibidores de desacetilases de histonas como agentes terapêuticos no cancro. Execução de várias técnicas de biologia molecular que permitirão avaliar o efeito de modulador epigenético dos inibidores de desacetilases de histonas em células de carcinoma de ovário. Modulação de vias de sinalização importantes no carcinoma de ovário (MAP cinases, Notch, p53 e HNF) através da exposição de linhas celulares humanas a inibidores de desacetilases de histonas, nomeadamente vorinostat e valproato. Western blotting para avaliação a fosforilação de Erk1/2, pertencente à via das MAP cinases, antes e após a exposição a vorinostat e valproato..PCR quantitativo para detecção da expressão de genes alvo da via Notch, Hey2 e Hes1, antes e após a exposição a vorinostat e valproato. Ensaios de Luciferase reporter gene para avaliação da actividade do promotor do p53 e do HNF antes e após a exposição a vorinostat e valproato. Ensaios de imunoprecipitação de cromatina para identificação de factores de transcrição envolvidos na activação dos promotores de p53 e HNF.
Bibliografia
Os responsáveis de cada módulo fornecerão a biliografia necessária (handhouts das aulas teóricas, artigos científicos e livros).
Método de ensino
As aulas teóricas serão ministradas com o apoio de métodos de suporte informático.
As aulas teórico-práticas serão leccionadas com o auxílio de meios audiovisuais, bem como pela exemplificação de técnicas laboratoriais.
As aulas práticas decorrerão em ambiente laboratorial com execução prática pelos alunos.
Método de avaliação
Cada módulo definirá os critérios a considerar para avaliação do próprio módulo (exames, participação nas aulas, capacidade de execução técnica, relatório).
A nota final será definida como a média ponderada, em relação aos respectivos ECTS, de todos os módulos frequentados.